EKSPERESI GEN

TUGAS MATA KULIAH

ILMU PEMULIAAN TERNAK

RESUME

EKSPERESI GEN

NAMA      : ARRA MUSYARRAFAH

NIM         : I  111 11 003

KELAS     : GANJIL                       

     

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2012

Ekspresi Gen

Ekspresi gen adalah proses dimana informasi dari gen yang digunakan dalam sintesis produk gen fungsional. Produk-produk ini seringkali protein, tetapi dalam non-protein coding gen seperti gen rRNA atau gen tRNA, produk adalah RNA fungsional. Proses ekspresi gen digunakan oleh semua kehidupan yang dikenal - eukariota (termasuk organisme multisel), prokariota (bakteri dan archaea) dan virus - untuk menghasilkan mesin makromolekul untuk hidup.

Gen struktur dan ekspresi gen dalam organisme yang lebih tinggi

Beberapa langkah dalam proses ekspresi gen dapat dimodulasi, termasuk transkripsi, RNA splicing, penerjemahan, dan pasca-translasi modifikasi protein. Regulasi gen memberikan kontrol sel atas struktur dan fungsi, dan merupakan dasar untuk diferensiasi selular, morfogenesis dan fleksibilitas dan adaptasi dari organisme. Regulasi gen juga dapat berfungsi sebagai substrat untuk perubahan evolusioner, karena kontrol dari waktu, lokasi, dan jumlah ekspresi gen dapat memiliki efek mendalam pada fungsi (tindakan) dari gen dalam sel atau dalam organisme multisel.

Dalam ekspresi gen genetika adalah tingkat yang paling mendasar di mana genotipe menimbulkan fenotip. Kode genetik adalah "ditafsirkan" oleh ekspresi gen, dan sifat dari produk ekspresi menimbulkan fenotipe organisme.

Mekanisme Gene Expression
Transkripsi

Gen itu sendiri biasanya bentangan panjang DNA dan tidak melakukan peran aktif. Ini adalah cetak biru untuk produksi RNA. Produksi salinan RNA dari DNA disebut transkripsi, dan dilakukan oleh RNA polimerase, yang menambahkan satu RNA nukleotida pada waktu ke untai RNA berkembang. Ini RNA komplementer terhadap DNA nukleotida yang ditranskripsi, yaitu T pada DNA berarti A akan ditambahkan ke RNA. Namun, dalam RNA yang mengandung nitrogen Urasil dasar dimasukkan bukan Timin dimanapun ada Adenin pada untai DNA. Oleh karena itu, komplemen mRNA dari untai DNA membaca "TAC" akan tercantum sebagai "AUG".

Pemrosesan RNA

Transkripsi gen pengkodean protein menciptakan transkrip primer RNA di tempat di mana gen itu berada. Transkrip ini dapat diubah sebelum diterjemahkan, hal ini sangat umum pada eukariota. Pengolahan RNA yang paling umum adalah untuk menghapus intron splicing. Intron adalah segmen RNA yang tidak ditemukan dalam RNA matang, meskipun mereka dapat berfungsi sebagai prekursor, misalnya untuk snoRNAs, yang merupakan RNA yang langsung modifikasi nukleotida dalam RNA lainnya. Intron yang umum di gen eukariotik tetapi jarang di prokariota.

Pemrosesan RNA, juga dikenal sebagai modifikasi pasca-transkripsi, bisa mulai selama transkripsi, seperti halnya untuk splicing, dimana spliceosome menghilangkan intron dari RNA yang baru terbentuk.

Ekstensif pengolahan RNA mungkin merupakan keuntungan evolusioner dimungkinkan oleh inti eukariota. Dalam transkripsi prokariota dan terjemahan (lihat di bawah) terjadi bersama-sama sementara pada eukariota membran nuklir memisahkan dua proses memberikan waktu untuk pemrosesan RNA terjadi.

non-coding RNA pematangan

Pada sebagian besar organisme non-coding gen (ncRNA) yang tercantum sebagai prekursor yang mengalami pengolahan lebih lanjut. Dalam kasus RNA ribosomal (rRNA), mereka sering ditranskripsi sebagai pre-rRNA yang mengandung satu atau lebih rRNA, pra-rRNA yang dibelah dan dimodifikasi (2'-O-metilasi dan pembentukan pseudouridine) di sebuah situs tertentu dengan sekitar 150 berbeda kecil nucleolus-terbatas RNA spesies, disebut RNA nukleolus kecil (snoRNAs), yang seperti snRNAs, snoRNAs bergaul dengan protein, membentuk snoRNPs. Pada eukariota, di snoRNP khususnya, yang disebut RNase MRP membelah 45S rRNA pra-ke 28S,, 5.8S rRNA 18S dan. The rRNA dan pengolahan RNA faktor adalah bentuk agregat besar disebut nucleolus tersebut.

Dalam kasus RNA transfer (tRNA), misalnya, 5 'urutan dihapus oleh RNase P, sedangkan ujung 3' akan dihapus oleh enzim Z tRNase .. Dalam kasus mikro RNA (Mirna), miRNAs yang pertama tercantum sebagai transkrip primer atau pri-Mirna dengan topi dan ekor poli-A dan diproses pendek, 70-nukleotida batang-loop struktur yang dikenal sebagai pra-Mirna dalam inti sel oleh enzim drosha dan Pasha, setelah diekspor, hal ini kemudian diolah untuk dewasa miRNAs dalam sitoplasma oleh interaksi dengan pemain dadu endonuklease, yang juga memprakarsai pembentukan RNA-induced membungkam kompleks (RISC), terdiri dari protein Argonaute.

RNA ekspor

Pada eukariota paling matang RNA harus diekspor ke sitoplasma dari inti. Sementara beberapa RNA berfungsi dalam nukleus, RNA banyak yang diangkut melalui pori-pori nuklir dan ke sitosol. Khususnya ini mencakup semua jenis RNA yang terlibat dalam sintesis protein. Dalam beberapa kasus RNA yang tambahan diangkut ke bagian tertentu dari sitoplasma, seperti sinaps, mereka kemudian ditarik oleh protein motor yang mengikat protein melalui linker untuk sekuens tertentu (disebut "zipcodes") pada RNA.

Terjemahan

Untuk beberapa RNA (non-coding RNA) RNA dewasa adalah produk gen selesai. Dalam kasus messenger RNA (mRNA) RNA adalah pembawa informasi pengkodean untuk sintesis satu atau lebih protein. mRNA membawa urutan protein tunggal (umum pada eukariota) adalah monosistronik sementara mRNA membawa urutan protein beberapa (umum di prokariota) dikenal sebagai polisistronik.

Setiap triplet nukleotida dari daerah pengkodean dari RNA sesuai dengan situs pengikatan untuk RNA transfer. RNA transfer membawa asam amino, dan ini dirantai bersama oleh ribosom. Ribosom membantu RNA transfer untuk mengikat messenger RNA dan mengambil asam amino dari masing-masing RNA transfer dan membuat struktur protein-kurang dari itu.

Dalam prokariota terjemahan umumnya terjadi pada titik transkripsi, sering menggunakan messenger RNA yang masih dalam proses yang diciptakan. Dalam eukariota terjemahan dapat terjadi dalam berbagai wilayah sel tergantung di mana protein yang ditulis seharusnya. Lokasi utama adalah untuk protein sitoplasma sitoplasma larut dan retikulum endoplasma untuk protein yang untuk ekspor dari sel atau dimasukkan ke dalam membran sel. Protein yang seharusnya diekspresikan pada retikulum endoplasma diakui bagian-jalan melalui proses penerjemahan. Ini diatur oleh partikel pengakuan sinyal - protein yang mengikat ke ribosom dan mengarahkan ke retikulum endoplasma ketika menemukan urutan sinyal pada rantai (baru lahir) asam amino tumbuh.

Folding

Enzim disebut chaperone membantu protein yang baru dibentuk untuk mencapai (lipat menjadi) struktur 3-dimensi yang dibutuhkan untuk berfungsi. Demikian pula, chaperone RNA RNA membantu mencapai bentuk fungsional mereka. Membantu protein folding merupakan salah satu peran utama dari retikulum endoplasma pada eukariota.
Protein transportasi

Banyak protein ditakdirkan untuk bagian lain dari sel daripada sitosol dan berbagai urutan signaling digunakan untuk mengarahkan protein ke tempat mereka seharusnya. Dalam prokariota ini biasanya suatu proses yang sederhana karena compartmentalisation terbatas sel. Namun dalam eukariota ada berbagai macam proses penargetan yang berbeda untuk memastikan protein tiba di organel yang benar.

Tidak semua protein tetap dalam sel dan banyak yang diekspor, untuk enzim pencernaan misalnya, hormon dan protein matriks ekstraseluler. Pada eukariota jalur ekspor dikembangkan dengan baik dan mekanisme utama untuk ekspor dari protein adalah translokasi ke retikulum endoplasmatic, diikuti oleh transportasi melalui aparatus Golgi.

Pengukuran ekspresi gen

Mengukur ekspresi gen adalah bagian penting dari banyak life sciences - kemampuan untuk mengukur tingkat di mana gen tertentu dinyatakan dalam sel, jaringan atau organisme dapat memberikan sejumlah besar informasi. Misalnya mengukur ekspresi gen dapat:

·                     Mengidentifikasi infeksi virus sel (viral protein ekspresi)

·                     Menentukan individu kerentanan terhadap kanker (onkogen ekspresi)

·                     Menemukan jika bakteri resisten terhadap penisilin (beta-laktamase ekspresi)

Demikian pula analisis lokasi ekspresi protein adalah alat yang ampuh dan ini dapat dilakukan pada organisme atau skala selular. Penyelidikan lokalisasi sangat penting untuk studi pembangunan dalam organisme multisel dan sebagai indikator fungsi protein dalam sel tunggal. Idealnya pengukuran ekspresi dilakukan dengan mendeteksi produk akhir gen (untuk banyak gen ini adalah protein) namun sangat sering lebih mudah untuk mendeteksi salah, biasanya mRNA, dan menyimpulkan tingkat ekspresi gen.

 

Kuantifikasi mRNA

Tingkat mRNA dapat secara kuantitatif diukur dengan Utara menggenapi yang memberikan ukuran dan urutan informasi tentang keberadaan molekul mRNA. Contoh RNA dipisahkan pada agarose gel dan dengan label radio RNA pesawat yang komplementer untuk urutan target. Radio berlabel RNA kemudian terdeteksi oleh autoradiograph. Masalah utama dengan menggenapi Utara berasal dari penggunaan reagen radioaktif (yang membuat prosedur yang memakan waktu dan berpotensi berbahaya) dan menurunkan kualitas kuantifikasi daripada metode yang lebih modern (karena fakta bahwa kuantifikasi dilakukan dengan mengukur band kekuatan dalam gambar gel). Menggenapi Utara, namun masih banyak digunakan sebagai ukuran informasi mRNA memungkinkan diskriminasi bergantian disambung transkrip.

Pendekatan rendah-throughput yang lebih modern untuk mengukur mRNA kelimpahan adalah reaksi berantai polimerase kuantitatif reverse transkripsi (RT-PCR diikuti dengan qPCR). RT-PCR pertama menghasilkan DNA template dari mRNA oleh reverse transkripsi. DNA template kemudian digunakan untuk qPCR di mana perubahan dalam sinyal fluoresens probe perubahan sejalan proses amplifikasi DNA. Dengan kurva standar yang dibangun dengan hati-hati qPCR dapat menghasilkan mutlak pengukuran seperti jumlah salinan mRNA, biasanya dalam satuan eksemplar nanolitre homogen jaringan atau eksemplar sel. qPCR sangat sensitif (deteksi molekul mRNA tunggal mungkin), tetapi bisa mahal karena untuk probe neon yang diperlukan.

Bercak Utara dan RT-qPCR yang baik untuk mendeteksi apakah sebuah gen tunggal yang dinyatakan, tapi dengan cepat menjadi tidak praktis jika banyak gen dalam sampel yang sedang dipelajari. Menggunakan DNA mikroarray transkrip tingkat untuk banyak gen sekaligus (ekspresi profil) dapat diukur. Baru-baru ini kemajuan teknologi microarray memungkinkan untuk kuantifikasi, pada satu array, transkrip tingkat setiap gen yang dikenal pada beberapa organisme genom, termasuk manusia.

Atau "tag berbasis" teknologi seperti Serial analisis ekspresi gen (bijak), yang dapat menyediakan pengukuran relatif dari konsentrasi selular berbeda messenger RNA, dapat digunakan. Keuntungan besar dari metode berbasis tag adalah "arsitektur terbuka", memungkinkan untuk pengukuran tepat setiap transkrip, dengan urutan yang dikenal atau tidak dikenal.

Kuantifikasi protein

Untuk gen pengkodean protein tingkat ekspresi langsung akan dinilai oleh sejumlah berarti dengan beberapa jelas analogi teknik untuk mRNA kuantifikasi.

Metode yang paling umum digunakan adalah untuk melakukan Western blot terhadap protein bunga - ini memberikan informasi tentang ukuran protein selain untuk identitasnya. Sampel (sering seluler lysate) dipisahkan pada polyacrylamide gel, ditransfer ke membran dan kemudian diselidiki dengan antibodi pada protein kepentingan. Antibodi juga dapat conjugated untuk fluorophore atau lobak peroxidase untuk pencitraan dan/atau kuantifikasi. Sifat gel berbasis assay ini membuat kuantifikasi kurang akurat tetapi memiliki keuntungan menjadi mampu mengidentifikasi perubahan pada protein, misalnya proteolisis atau ubiquitination, dari perubahan dalam ukuran.

Dengan mengganti gen dengan versi baru menyatu protein berpendar hijau (atau serupa) penanda ekspresi dapat diukur secara langsung dalam sel-sel hidup. Hal ini dilakukan dengan pencitraan menggunakan mikroskop fluoresens. Sangat sulit untuk mengkloning menyatu GFP protein ke lokasi asli di genom tanpa mempengaruhi tingkat ekspresi sehingga metode ini sering tidak dapat digunakan untuk mengukur ekspresi gen endogen. Itu adalah, namun, digunakan untuk mengukur ekspresi gen artifisial diperkenalkan ke dalam sel, misalnya melalui ekspresi vektor. Sangat penting untuk dicatat bahwa oleh sekering protein target untuk perilaku neon wartawan protein, termasuk lokalisasi selular dan ekspresi tingkat, dapat secara signifikan diubah.

Enzyme-linked immunosorbent assay bekerja dengan menggunakan antibodi yang immobilised di atas piring pencampur untuk menangkap protein menarik dari sampel yang ditambahkan ke sumur. Menggunakan deteksi antibodi conjugated dengan enzim atau fluorophore jumlah protein yang terikat secara akurat dapat diukur dengan fluorometric atau colourimetric deteksi. Proses deteksi sangat mirip dengan Western blot, tetapi dengan menghindari langkah gel kuantifikasi lebih akurat dapat dicapai.

 

Lokalisasi

Analisis ekspresi ini tidak terbatas hanya kuantifikasi; lokalisasi dapat juga ditentukan. mRNA dapat dideteksi dengan seuntai mRNA komplementer sesuai berlabel dan protein dapat dideteksi melalui berlabel antibodi. Menggali sampel kemudian diamati oleh mikroskopi untuk mengidentifikasi di mana mRNA atau protein.

 

 

 

Peraturan Gene Expression

Regulasi ekspresi gen mengacu pada kontrol jumlah dan waktu penampilan dari produk gen fungsional. Pengendalian ekspresi sangat penting untuk memungkinkan sel untuk menghasilkan produk gen yang dibutuhkan saat dibutuhkan mereka, pada gilirannya ini memberikan sel-sel fleksibilitas untuk beradaptasi dengan lingkungan variabel, sinyal eksternal, kerusakan sel, dll Beberapa contoh sederhana di mana ekspresi gen yang penting adalah:

·                Kontrol ekspresi insulin sehingga memberikan sinyal untuk regulasi glukosa darah

·                Inaktivasi kromosom X pada mamalia betina untuk mencegah sebuah "overdosis" dari gen yang dikandungnya.

·                Tingkat ekspresi cyclin mengendalikan perkembangan melalui siklus sel eukariotik

Lebih umum regulasi gen memberikan kontrol sel atas semua struktur dan fungsi, dan merupakan dasar untuk diferensiasi selular, morfogenesis dan fleksibilitas dan adaptasi dari organisme.

Setiap langkah ekspresi gen dapat dimodulasi, dari langkah DNA-RNA transkripsi untuk modifikasi pasca-translasi protein. Stabilitas produk gen akhir, apakah itu adalah RNA atau protein, juga memberikan kontribusi terhadap tingkat ekspresi gen - sebuah hasil produk yang tidak stabil dalam tingkat ekspresi yang rendah. Secara umum ekspresi gen diatur melalui perubahan dalam jumlah dan jenis interaksi antara molekul yang secara kolektif mempengaruhi transkripsi DNA dan translasi RNA.

 

Transkripsi regulasi

Peraturan transkripsi dapat dibagi ke dalam tiga rute utama dari pengaruh; genetik (interaksi langsung dari faktor kontrol dengan gen), modulasi (interaksi dari faktor kontrol dengan mesin transkripsi) dan epigenetik (non-urutan perubahan dalam struktur DNA yang mempengaruhi transkripsi).

Interaksi langsung dengan DNA adalah metode paling sederhana dan paling langsung protein dapat mengubah tingkat transkripsi dan gen sering memiliki situs beberapa protein yang mengikat seluruh wilayah coding dengan fungsi spesifik mengatur transkripsi. Ada banyak kelas situs DNA peraturan mengikat dikenal sebagai peningkat, isolator, represor dan peredam suara. Mekanisme untuk mengatur transkripsi sangat bervariasi, dari memblokir situs mengikat kunci pada DNA polimerase RNA bertindak sebagai suatu aktivator dan mempromosikan transkripsi dengan membantu mengikat RNA polimerase.

Aktivitas faktor transkripsi lebih lanjut dimodulasi oleh sinyal-sinyal intraseluler menyebabkan protein modifikasi pasca-translasi termasuk terfosforilasi, asetat, atau glikosilasi. Perubahan ini mempengaruhi kemampuan faktor transkripsi untuk mengikat, secara langsung atau tidak langsung, untuk DNA promotor, untuk merekrut RNA polimerase, atau untuk mendukung pemanjangan molekul RNA yang baru synthetized.

Membran nuklir di eukariota memungkinkan pengaturan lebih lanjut faktor transkripsi oleh durasi kehadiran mereka dalam inti yang diatur oleh perubahan reversibel dalam struktur mereka dan dengan mengikat protein lainnya. Rangsangan lingkungan atau sinyal endokrin dapat menyebabkan modifikasi dari protein regulasi memunculkan air terjun sinyal intraseluler, yang mengakibatkan dalam regulasi ekspresi gen.

Lebih baru-baru ini telah menjadi jelas bahwa ada pengaruh yang sangat besar non-DNA-urutan efek khusus pada terjemahan. Efek ini disebut sebagai epigenetik dan melibatkan struktur tatanan yang lebih tinggi DNA, protein non-urutan DNA spesifik mengikat dan modifikasi kimia DNA. Secara umum efek epigenetik mengubah aksesibilitas DNA untuk protein sehingga memodulasi transkripsi.

Metilasi DNA adalah mekanisme luas bagi pengaruh epigenetik pada ekspresi gen dan terlihat pada bakteri dan eukariota dan memiliki peran dalam transkripsi dan diwariskan membungkam regulaton transkripsi. Pada eukariota struktur kromatin, dikendalikan oleh kode histon, mengatur akses ke DNA dengan dampak signifikan terhadap ekspresi gen dalam euchromatin dan daerah heterochromatin.

Pasca-transkripsi regulasi

Pada eukariota, dimana ekspor RNA diperlukan sebelum terjemahan adalah mungkin, ekspor nuklir diperkirakan untuk memberikan kontrol tambahan atas ekspresi gen. Semua transportasi di dan keluar dari inti adalah melalui pori nuklir dan transportasi dikendalikan oleh berbagai importin dan exportin protein.

Ekspresi gen coding untuk protein hanya mungkin jika messenger RNA membawa kode bertahan hidup cukup lama untuk diterjemahkan. Dalam sel yang khas sebuah molekul RNA hanya stabil jika khusus dilindungi dari degradasi. Degradasi RNA memiliki kepentingan tertentu dalam regulasi ekspresi dalam sel eukariotik mana mRNA telah melakukan perjalanan jarak yang signifikan sebelum diterjemahkan. Pada eukariota RNA tertentu distabilkan oleh modifikasi pasca-transkripsi, terutama tutup 5 'dan poli-adenylated ekor.

Disengaja degradasi mRNA digunakan tidak hanya sebagai mekanisme pertahanan dari RNA asing (biasanya dari virus), tetapi juga sebagai rute mRNA destabilisasi''''. Jika molekul mRNA memiliki urutan komplementer RNA campur kecil maka sasaran perusakan melalui jalur interferensi RNA.

Translasi regulasi

Peraturan langsung dari terjemahan ini lebih menonjol dibandingkan kontrol stabilitas mRNA transkripsi atau tetapi kadang-kadang digunakan. Inhbition dari translasi protein adalah target utama untuk racun dan antibiotik untuk membunuh sel dengan menimpa gen normal mengendalikan ekspresi. Protein inhibitor sintesis termasuk antibiotik neomisin dan racun risin.

Protein degradasi

Setelah selesai sintesis protein tingkat ekspresi protein yang dapat dikurangi dengan degradasi protein. Ada jalur utama degradasi protein dalam semua prokariota dan eukariota yang proteasome adalah komponen umum. Sebuah protein yang tidak diperlukan atau rusak sering diberi label untuk degradasi oleh penambahan ubiquitin.

Sistem ekspresi gen

Sistem ekspresi adalah sebuah sistem yang dirancang khusus untuk produksi produk gen pilihan. Hal ini biasanya protein meskipun juga mungkin RNA, seperti tRNA atau ribozyme. Sistem ekspresi terdiri dari gen, biasanya dikodekan oleh DNA, dan mesin molekul yang diperlukan untuk menuliskan DNA ke mRNA dan menerjemahkannya mRNA protein yang menggunakan reagen yang disediakan. Dalam arti luas ini mencakup setiap sel hidup namun istilah ini lebih biasanya digunakan untuk merujuk pada ekspresi sebagai alat laboratorium. Sistem ekspresi sering buatan dalam beberapa cara. Sistem ekspresi adalah, namun, proses dasarnya alami. Virus adalah contoh yang sangat baik di mana mereka meniru dengan menggunakan sel sebagai sistem ekspresi untuk protein viral dan genom.

 

Di alam

Selain untuk alat-alat ini biologis, tertentu secara alami mengamati konfigurasi DNA (gen, promotor, Enhancer, repressors) dan terkait mesin itu sendiri dirujuk sebagai sistem ekspresi. Istilah ini biasanya digunakan dalam kasus di mana sebuah gen atau set gen dihidupkan kondisi didefinisikan dengan baik. Sebagai contoh sederhana menjadi penekan 'beralih' sistem ekspresi Lambda fag dan sistem operator lac di bakteri. Beberapa sistem ekspresi alam langsung digunakan atau diubah dan digunakan untuk ekspresi buatan sistem seperti sistem Tet-on dan Tet off ekspresi.

Ekspresi gen Teknik

Teknik-teknik eksperimental berikut ini digunakan untuk mengukur ekspresi gen dan terdaftar dalam urutan kronologis kasar, dimulai dengan, teknologi yang lebih tua lebih mapan. Mereka dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan derajat mereka multiplexity.

Rendah-ke-pertengahan-kompleks teknik:

o         Gen reporter

o         Northern Blot

o         Western blot

o         Hibridisasi in situ fluorescent

o         Transkripsi balik PCR

Tinggi-kompleks teknik:

o         SAGE

o         DNA microarray

o         Ubin Array

o         RNA-seq